干细胞应用
当前位置 > 首页 > 干细胞应用




羊膜干细胞

全世界每年约有千万以上人群遭受各种形式的创伤,数百万人因疾病康复过程重要器官发生纤维化而导致功能丧失。对于只采用药物疗法而不能得以恢复的严重损伤,不得不依靠人工脏器或脏器移植来解决。而器官移植仍然是一种有损伤和有代价的治疗方法,并且由于受到伦理以及机体免疫排斥等方面的限制很难满足临床救治的需要。因此,利用工程学和生命科学的原理和技术,在体外预先构建一个有生命的种植体或体外装置,用于修复组织缺损,替代器官的部分或全部功能,具有极为重要的意义。利用组织工程学技术能制造出含有特定活性的细胞群落,将后者直接移植或者播种于可降解材料上,不但有良好的生物相容性,同时还具有生长潜力,在临床上具有广泛的应用前景。所谓再生医学就是以利用人类的自然治愈能力,使受到巨大创伤的机体组织或器官获得自己再生能力为目的的医学,包括组织工程、细胞和细胞因子治疗、基因治疗、微生态治疗等。再生医学研究的核心问题在于移植细胞源(种子细胞)的筛选和培养、移植材料和移植途径的选择,以及一系列与其相关的试验学方法。目前在再生医学领域研究得最多的是干细胞,而干细胞涉及的伦理道德还缺乏相应的规范,临床广泛应用尚需时日。近年来研究发现,羊膜组织细胞具有干细胞样特性,可以诱导分化成各种组织细胞,容易获得,而又不引起任何伦理争议。羊膜组织细胞的这些优势使其作为干细胞的具有广阔前景的替代物。

1 羊膜组织细胞的生物学特性

羊膜中的羊膜上皮细胞(hAEC)、人羊膜间充质基质细胞(hAMSC)具有干细胞特征,研究及应用羊膜及羊膜来源细胞将具有广泛的前景。

1.1 羊膜上皮细胞

羊膜上皮细胞(hAEC)HLA-DR 表达缺失,不表达HLA-A、B、C,羊膜组织不能刺激人外周血T 细胞活化及CD8+T 细胞亚群表面分子CD69 产生活化表达,免疫源性极低,体内细胞移植不引发免疫排斥。羊膜上皮细胞能产生各种生长因子如表皮细胞生长因子(EGF)、转移生长因子β(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及白细胞介素-10(IL-10)等,其中50多种可检测到。这些细胞因子可能通过单独或网状途径加速嗜中性粒细胞的程序性死亡,然后影响胶原酶的产生及其相关功能,从而减轻炎症;在体外实验中发现,羊膜上皮细胞可能通过分泌一种可溶性因子抑制先天免疫和获得性免疫;还能抑制纤维化和新生血管形成,可以减少血管化的肉芽组织。

hAECs表达人类胚胎干细胞的相关蛋白,包括:POU 区域、class5、转录因子1、Nanog 同源异形盒、SRY-box 2 和SSEA-4。通过对细胞表型、mRNA 表达、免疫细胞化学和超微结构进行分析,在体外可以诱导分化为心肌、肌肉、骨、脂肪、胰腺、肝细胞、神经元和星形胶质细胞。

近年来多项研究表明,hAECs中存在有神经元前体细胞或干细胞,有合成释放生物活性物质和神经营养因子的功能;在培养基内的羊膜细胞处于多分化状态,表达神经外胚层、中胚层和内胚层的标志蛋白,在神经诱导培养基中培养的羊膜细胞表现为神经细胞的形态并且神经特异性基因表达上调。培养的羊膜上皮细胞合成和释放活化素(Activin)和头蛋白(Noggin)。ActivinA 可以诱导初始反应基因(primary response gene) Nogginm RNA 的表达, 提示羊膜上皮细胞内存在Activin 信号路径,人类羊膜组织中有可能包含有早期发育的神经元。对人类和哺乳类动物的羊膜细胞生物学特性进行深入研究后发现,培养人羊膜上皮细胞中有RC1、Vimentin、A2B5、NFP、MAP2、GFAP 等免疫组织化学染色阳性细胞,提示羊膜上皮细胞中存在多潜能的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的前体细胞。而后又在组织学、蛋白质和mRNA 水平证实了少突胶质细胞特异性标记物髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)、环核苷酸磷酸二脂酶CNPase、蛋白脂质蛋白(proteolipid protein,PLP)的表达。研究发现,人羊膜组织中存在Nestin/GFAP 双阳性细胞,Vimentin 和PSA-NCAM 阳性细胞, 以及Nestin/GFAP 双阳性细胞;这些双阳性细胞表达Vimentin 和Nestin 两种神经干细胞的标志物,也表达神经元的标志物NSE 和β-微血管蛋白(β-tubulin);大部分细胞表达多巴胺能神经元的标志物TH,少数细胞表达星型胶质细胞的标志物GFAP。

1.2 人羊膜间质细胞

人羊膜间充质基质细胞(hAMSC)能够产生前列腺素,并表达神经祖细胞和心肌细胞的一些标志。从羊膜中培养、扩增出hAMSC,经免疫表型鉴定与骨髓来源的MSC相似,且其比骨髓来源的MSCs具有更强的扩增能力。hAMSC在体外可以诱导分化为脂肪细胞和软骨细胞,证实了其具有分化为成熟的中胚层细胞的能力。采用酶消化法从羊膜中分离、培养出间质干细胞,并在体外诱导向神经元样细胞分化,证实了其分化为成熟的外胚层细胞的能力。将hAMSC在体外通过血管内皮生长因子(VEGF)的诱导作用,可成功地分化成血管内皮细胞,这对血管移植组织工程的发展将会有很大促进作用。在适当的培养条件下,从羊膜中分离出间质细胞经体外扩增后,显示出有分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞和神经细胞的潜能,经RT - PCR技术分析人羊膜细胞具有低免疫原性。

2 羊膜干细胞的应用

2.1 在中枢神经损伤修复中应用

2.1 在中枢神经损伤修复中应用
在治疗神经系统疾病方面,hAEC有特别的潜能。由于hAEC具有干细胞的特征,表达神经系统和神经胶质标志物以及神经系统特异蛋白,产生和分泌神经递质、多种神经营养因子,如脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)等,促进神经元的存活及其轴突生长,因此,可用其来进行细胞治疗,在神经系统疾病中的应用有着极为重要的意义。

1)缺血性脑损伤:羊膜上皮细胞具有改善神经元功能与活性作用。将人羊膜细胞移植到SD大鼠脑损伤模型的脑内,人羊膜细胞可以在脑内存活至移植后4 周,并且能表达神经元特异性抗原MAP2,移植组动物后肢功能较对照组明显改善,提示人羊膜细胞移植治疗能有效改善神经功能。培养的羊膜上皮细胞中存在有神经元和神经干细胞表面标记Nestin、MAP2 的阳性细胞,同时表达Nestin mRNA;将纯化后的神经元干细胞进行脑缺血模型的脑内细胞移植, 移植细胞可以迁移到缺血部位,与脑缺血部位相应的神经元成活。羊膜上皮细胞能促进体外培养的神经干细胞的分化,且主要向神经元分化,并促进神经元初级突起的生长。提示羊膜上皮细胞为神经干细胞提供促进其分化及存活适宜的微环境。

2)脊髓损伤:羊膜上皮细胞具有修复神经系统损伤的作用。利用体外培养标记的人羊膜上皮细胞移植治疗猴脊髓损伤,通过15~60d 观察,移植部位有成活的人羊膜上皮细胞存在,并且宿主脊髓中有与羊膜上皮细胞同样标记物的神经元和轴突,治疗组脊髓损伤侧后肢运动功能恢复明显优于对照组。治疗组移植物内可见AchE、TH 阳性神经纤维和GFAP 阳性的神经胶质细胞,移植物内有荧光金染色。将人羊膜细胞移植入脊髓损伤大鼠模型体内,采用Basso、Beatlie、Bresnahan(BBB)运动功能评分并将组织取材进行形态学观察,移植组从术后第2 周开始后肢功能迅速恢复,到第4 周达平台期,观察结束时移植组BBB 评分明显好于对照组。在移植后第2 周和8 周都能见到羊膜细胞,但是随着时间延长细胞数量逐渐减少。其原因可能是:羊膜细胞最大限度的保存了神经元,使得神经环路的完整性强于非移植组;促进中间神经元的发育、再生,建立上下环路部分联系; 羊膜细胞提供的营养因子促进了脊根神经节的发育,增强了本体感觉环路所介导的反射形成。

3)帕金森病(PD):缓解帕金森病的临床症状。PD 是常见于老年人,是一种神经退行性病变,以脑的苍白球及黑质的多巴胺(DA)进行性减少为特征,目前尚缺乏有效的治疗措施。研究表明,羊膜细胞能够合成并产生DA,分子水平研究证实羊膜上皮细胞有酪氨酸羟化酶(TH)的mRNA 和蛋白质表达,在培养羊膜上皮细胞中,约10%的细胞酪氨酸羟化酶免疫组织化学染色阳性。酪氨酸羟化酶阳性细胞体内移植治疗大鼠帕金森病模型的实验表明,其不仅可以缓解帕金森病的临床症状,而且脑内移植细胞可以存活并具有产生DA 的功能。资料显示,用人羊膜上皮细胞移植治疗帕金森病大鼠,治疗组PD 大鼠的旋转行为改善明显达14 周,BDNF 基因修饰的hAECs 组能使恢复时间提前。hAECs 可以作为一种治疗PD 的供体细胞。还有人将人羊膜细胞移植入MPTP 所致的大鼠PD 模型脑内纹状体, 检测MPTP 对黑质内细胞的毒性、移植细胞的存活情况和内源性神经细胞再生,以及纹状体内BDNF 和GDNF 水平。结果显示人羊膜细胞表达神经前体细胞的标志并且能分化成神经细胞、DA 能神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,TH 阳性神经细胞在对照组的黑质内明显减少,在移植治疗组明显增加,免疫组化显示移植的细胞在PD 大鼠脑内存活,侧脑室下区的BrdU 阳性细胞和纹状体内的神经营养因子水平明显增加。

2.2 外周神经损伤修复中的应用:

应用羊膜来源间充质干细胞移植治疗SD 大鼠坐骨神经损伤, 步态分析结果显示移植治疗组明显优于对照组, 移植治疗组的肌肉复合动作电位的波幅百分比为43%, 对照组为29%,动作电位传导潜伏期分别为1.7ms 和2.5ms,移植组治疗效果优于对照组。

2.3 肝脏再生修复中的应用

肝细胞移植已经成为肝脏疾病治疗的新方法。然而,缺乏合适的肝细胞为制约该技术发展的瓶颈。hAEC表达一些肝细胞基因和功能,经过有效和高效的方法诱导完全的肝细胞分化,hAEC将成为肝细胞移植的有用的细胞来源。hAEC向肝细胞分化的临床前研究令人鼓舞。在体外,已经分化出表达很多肝功能的细胞,包括转录因子HNF3γ、C/EBPα、HNF1和HNF4α等;分化的肝细胞基因,包括Alb、α1抗胰蛋白酶(A1AT)、葡萄糖6-磷酸酶等;以及药物代谢基因;移植后hAEC能在肝内成功植入,存活6个月以上。应用Western blot技术,在小鼠血清中能检测到人A1AT;腹腔接受人羊膜移植的SCID小鼠,在其血清和腹水中可检测到人白蛋白;这些结果表明hAEC在小鼠体内执行重要的肝脏功能。hAEC定向分化的肝细胞最少表达30多个已知在成熟肝细胞表达的基因,提示移植hAEC来源的肝细胞可能为一种肝脏疾病有效的治疗方法。这些表达的重要肝细胞基因为A1AT、OTC、CPS-I和UGT1A1。这些基因突变引起的代谢性肝脏疾病现在已可被肝移植矫正。hAEC移植可能为这些代谢缺陷患者提供一种新的可能治疗方法。

2.4 缺血性心脏疾病治疗中的应用

心肌缺血、梗死是终末期闭塞性血管性疾病的严重后果。现在的治疗措施是不充分的、姑息性的。细胞心肌成形术是治疗心肌细胞缺血性损伤的主要方法,但是由于心肌细胞不能有效地分化,从而通常会导致心力衰竭。因此,人们致力于寻找用于细胞心肌成形术的合适细胞。研究发现,将hAMCs移植入心肌梗死的鼠心脏后,hAMCs 在瘢痕组织中存活至少2 个月并且能分化成心肌细胞。将hAMSC与新生大鼠心脏组织共培养,hAMSC可整合入心脏组织并分化为心肌细胞样细胞。由透明质酸、丁酸和维甲酸组成的混合酯可促进人羊绒膜来源的细胞向心/血管细胞分化。以维甲酸处理的hAMSC和hCMSC表达心脏和内皮细胞标志物如vWF,可增强梗死大鼠心脏的心肌修复。hAMSC和hCMSC移植物可增高梗死侧心脏的毛细血管密度,正常化左室功能,减少瘢痕形成。移植混合酯预处理的hAMSC和hCMSC更进一步增高毛细血管密度,产生表达人vWF的细胞,减小梗死面积。有些植入的经维甲酸预处理的hAMSC和hCMSC连接蛋白43和心肌钙蛋白Ⅰ也为阳性。这些改善可能与移植人MSC后,局部或旁分泌血管生成、抗凋亡及促有丝分裂因子有关,以及与hAMSC和hCMSC向血管细胞分化有关。这些发现可提供心力衰竭新的细胞治疗途径。

2. 5 听觉系统损伤修复

在听觉系统,干细胞存在于内耳及螺旋神经节组织,并且能发育成毛细胞和神经元。大多数听觉损伤病例都是由毛细胞缺失引起的,这种感知细胞存在于内耳并可将声音转换成神经信号。但是,由于干细胞在出生后迅速减少而不能再生缺失的细胞。因此,细胞移植就成了修复耳蜗损伤的最佳途径。体外培养的人羊膜上皮细胞在其细胞膜和细胞核上都表达Cx26 基因(该基因的突变可导致听觉丧失)及在细胞膜和细胞质中表达Na+ 2K+ 2AT2Pase。在体内,移植入豚鼠耳蜗的羊膜上皮细胞能存活至少3周,并且表达Cx26和Na+ 2K+ 2ATPase,已知这些因子表达于耳蜗的纤维细胞,这表明hAEC具有纤维细胞样细胞的功能。

2.6  I型糖尿病治疗

胰岛素形成细胞对于治疗1型糖尿病而言,整个胰腺或胰岛移植可避免2次并发症,也可控制血糖水平,但移植材料的短缺仍然是个大问题。研究发现,在体外用烟酰胺刺激培养的人羊膜上皮细胞后可表达胰岛素mRNA;体内试验中,移植hAEC7周后可使链脲酶素诱导的糖尿病小鼠模型体内的血糖浓度正常。在移植hAEC后,血糖浓度正常化的糖尿病小鼠中,有20%的小鼠在移植后6周出现高血糖症状,这可能与移植细胞的半衰期有关。虽然存在问题,但应用hAEC移植治疗糖尿病仍然值得期待。

2. 7 软骨细胞

hAMC可表达成骨相关基因,如SOX29、SOX25、SOX26、骨形态发生蛋白BMP22 和24 以及BMP的受体;将hAMC与BMP22共同移植入小鼠的无软骨组织或与胶原支架一起植入生长缺陷的兔骨中,均可出现形态的改变和2型胶原沉积,说明hAMC具有软骨分化潜能,可作为软骨疾病及损伤治疗的新材料。

羊膜来源细胞具有干细胞特征,可分化为多种组织细胞,使其更适用于组织工程的细胞来源,是组织再生工程中很有潜力的材料来源;羊膜上皮细胞和间质细胞的分离纯化技术日渐成熟,为今后大规模的应用奠定了基础。因此,羊膜及羊膜来源细胞的应用将具有广阔的前景。在临床应用中,如何获得并保存个体羊膜细胞以备将来应用,采取怎样的保存方法才能尽可能地保持其完整性及细胞活性等问题,仍需要进一步的研究来解决。

All Rights Reserved 版权所有:江西瑞济生物工程技术股份有限公司 赣ICP备17003895号-1 免责声明

地址:江西省南昌市高新开发区尤口路498号 电话:0791-86253724 传真:0791-86224040

a>